Немецкая компания NanoTemper Technologies GmbH разработала метод под названием микромасштабный термофорез (микротермофорез) – Microscale Thermophoresis (MST). Основу метода определяет эффект термофореза, за локальное изменение температуры отвечает инфракрасный лазер, а при помощи флуоресцентного микроскопа возможно регистрировать изменения сигнала от молекул в режиме реального времени. Метод MST является быстрым и точным методом количественного определения взаимодействий между молекулами. Чувствительность термофоретического эффекта к разделению молекулы и растворителя позволяет количественно определять взаимодействия биомолекул. Это достигается путем обнаружения даже незначительных изменений в конформации, заряде и размере молекулы вследствие их взаимодействия. В 2010 году компания выпустила первый прибор для определения силы связывания биомолекул серии Monolith NT.115.
Диапазон размеров веществ, которые можно измерять с помощью MST, крайне велик (Рис.).
Одной из ключевых особенностей метода является возможность работать в условиях, приближенных к естественным. Измерения проводятся в растворе (возможность измерения в биожидкостях) и не требуют иммобилизации образцов. Таким образом, условия измерения сильно приближены к естественным. Используя подход титрования, MST позволяет измерять константы диссоциации в широком спектре взаимодействий. Оценка аффинности биомолекул возможна в пределах широкого диапазона измеряемых констант диссоциации - от 10-12М до 10-3 М.
Теоретическая основа метода термофореза
Локальная разность температур ΔT приводит к локальному изменению концентрации молекулы (истощение или обогащение), количественно определяемой с помощью коэффициента Соре:
ST = Chot / Ccold = exp (-STΔT)
Термодиффузия флуоресцентных молекул отслеживается в экспериментах титрования, в которых состав буферного раствора остается постоянным. Поскольку буферный раствор не меняется, изменения в термодиффузном истощении или обогащении могут возникнуть только в результате изменения размера, заряда или энтропии сольватации флуоресцентных молекул. Так как взаимодействие не флуоресцентных молекул с меченой молекулой изменяет по меньшей мере одно из этих свойств, количественная оценка взаимодействия может быть определена путем измерения изменения в термодиффузии.
Термодиффузное движение флуоресцентных молекул измеряется путем мониторинга распределения флуоресценции F внутри капилляра при помощи устройства Monolith. Микроскопические изменения градиентов температуры создаются инфракрасным лазером, луч которого направлен на капилляр и сильно поглощается водой. Температура водного раствора внутри лазерного луча увеличивается на 2К-6К по сравнению с периферией, обеспечивая высокий градиент температуры. Перед включением инфракрасного лазера в капилляре наблюдается равномерное распределение молекул. После включения инфракрасного лазера прослеживаются два эффекта, разделенных во времени. Первый – изменение флуоресценции красителя вследствие наличия температурной зависимости. Второй – перемещение молекул из локально нагретой области во внешние холодные области. Концентрация молекул в локально нагретой области уменьшается до тех пор, пока не достигнет устойчивого состояния (достигается за 10 - 30 секунд).
Рисунок: Термодиффузионный анализ.
Платформа для загрузки 16 капилляров. Возбуждение и детекция флуоресценции происходит через один объектив. ИК-лазер используется для локального нагрева образца. (В) Верхняя панель. Типичная термофоретическая кривая, получаемая с одного капилляра. Первоначально молекулы равномерно распределены, и измеряется постоянная «начальная» амплитуда флуоресценции. В течение первой секунды после активации ИК-лазера наблюдается «T-Скачок», что соответствует быстрому изменению свойств флуорофора из-за быстрого изменения температуры. Впоследствии может быть обнаружено термофоретическое движение флуоресцентно меченных молекул из нагретого объема образца. Обычно изменение флуоресценции измеряют в течение 30 с. После деактивации ИК-лазера происходит обратный Т-переход, за которым следует «обратная диффузия» молекул. Нижняя панель. Типичный эксперимент по связыванию. Термофоретическое движение флуоресцентной молекулы (черная кривая; «несвязанное состояние») изменяется при связывании с нефлуоресцентным лигандом (серая кривая; «связанное состояние»), что приводит к различным кривым. Для анализа изменение в термофорезе выражается как изменение в нормированной флуоресценции (ΔFnorm), которая определяется как Fhot / Fcold (F-значения соответствуют средним значениям флуоресценции между определенными областями). Титрование нефлуоресцентного лиганда приводит к постепенному изменению термофореза, который наносится на график как ΔFnorm, для получения кривой связывания и дальнейшего получения константы связывания.
ST определяет равновесное соотношение концентраций Сhot/Сcold = exp(-STΔT) ≈ 1-(STΔT) при повышении температуры ΔT. Нормированная флуоресценция Fnorm позволяет измерить это соотношение концентраций, а также температурную зависимость флуоресценции красителя. В линейном приближении ожидается Fnorm = Fhot/Fcold=1-(ST-dF/dT) ΔT.
Константа диссоциации определяется из уравнения KD=[A]*[T]/[AT], где [A] – концентрация свободных флуоресцентных молекул, [T] – концентрация свободных молекул титранта и [AT] – концентрация комплекса, состоящего из A и T.
Метод микротермофореза является очень быстрым, точным и простым в использовании методом для определения межмолекулярных взаимодействий. Приборы серии Monolith являются прекрасными помощниками в определении константы диссоциации. Вы сможете проводить эксперименты в условиях, приближенных к естественным. Интуитивно понятное программное обеспечение, которое будет помогать на всех этапах проведения эксперимента не оставит равнодушным.
Технология MST завоевала сердца и умы многих исследователей. Опубликовано множество высокорейтинговых работ на основе MST.
Попробуйте и убедитесь в этом сами! Грандиозных идей и открытий! А мы поможем Вам с реализацией!
