Это быстрый, точный и простой метод для оценки термической стабильности белковой молекулы и ее конформационных особенностей. Кроме того, вы сможете оценить коллоидные свойства раствора белка, условия хранения, сравнить препараты на различных этапах очистки и все это за минуты!
Белки - важнейшие клеточные макромолекулы, которые участвуют во всех биологических процессах и выполняют множество функций. Для правильного функционирования белка очень важным является его пространственная структура. Обычно белок в свернутом состоянии в физиологических условиях является наиболее стабильным.
Большое значение в пространственной структуре белковой молекулы имеет гидрофобный эффект. Гидрофильные аминокислоты с большей вероятностью будут располагаться на поверхности белка, в то время как гидрофобные аминокислоты будут «прятаться» в более недоступные для растворителя области и скрываться за другими остатками. После мягкого температурного воздействия на белковую молекулу, при котором не произойдет разрыва цепи и агрегации, при восстановлении комфортных условий (медленное охлаждение) белок снова примет свою нативную форму.
Денатурация белковой молекулы, а также наличие агрегатов в растворе являются одними из основных причин потери функциональной активности белка. С помощью метода nanoDSF возможно обнаруживать наименьшие изменения флуоресценции ароматических остатков аминокислот, присутствующих практически во всех белках. В процессе термического разворачивания триптофановые остатки, которые обычно располагаются внутри гидрофобного кора белка начинают показываться на поверхность. Флуоресценция триптофанов и тирозинов в белке сильно зависит от их близкого окружения. Располагаясь внутри гидрофобного ядра белков, они экранируются от окружающего водного растворителя. В процессе разворачивания происходит изменение интенсивности флуоресценции и/или длины волны максимума излучения. Таким образом становится возможным определение термодинамических параметров и температуры плавления (Tm) (Grimsley, G.R., et al., Determining the conformational stability of a protein from urea and thermal unfolding curves. Curr Protoc Protein Sci, 2013. Chapter 28: p. Unit28 4.). Температура плавления Tm (°C) – точка полуразворачивания, определяет то состояние, при котором половина белковой молекулы развернута. При проведении тепловой денатурации с использованием метода ДСФ контролируется внутренняя флуоресценция триптофановых остатков, которая очень чувствительна к их близкому окружению и изменяется при термическом разворачивании.
При проведении эксперимента термической денатурации образец загружается в стеклянные капилляры, которые помещаются на термоплатформу. Возбуждение флуоресценции происходит с помощью светодиода при длине волны 285 нм. Детекция флуоресценции происходит одновременно с помощью двойного UV-детектора на длинах волн 330 нм и 350 нм, каждые 3 секунды сканируя всю платформу. Во время эксперимента образцы измеряются непрерывно, обеспечивая сверхвысокое разрешение с более чем 20 точками данных в минуту. Образцы могут быть нагреты до любой температуры в диапазоне от 25 °С до 95 °С с шагом от 0.10С/мин. Как упоминалось выше, гидрофобные остатки триптофана чаще всего прячутся внутри белкового кора, что приводит к пику эмиссии при длине волны 330 нм. В процессе разворачивания белка остатки триптофана постепенно показываются наружу, что приводит к смещению пика эмиссии в сторону 350 нм. Приборы серии Prometheus и Tycho в режиме реального времени предоставляют кривые изменения флуоресценции белковой молекулы при разворачивании не только при длинах волн 330 нм, 350 нм, но также и при отношении длин волн 330 нм/350 нм, что позволяет фиксировать малейшие изменения флуоресценции при разворачивании белка.
Помимо определения конформационных свойств белковых молекул с помощью метода ДСФ можно детектировать агрегацию в растворе. С помощью дополнительной оптики агрегаты обнаруживаются путем измерения потери интенсивности отраженного света в результате рассеивания. Разность между испускаемым и отраженным светом используется для количественного определения агрегации. Величина потери света зависит от размера частиц и концентрации. С помощью технологии nanoDSF мы можем обнаружить агрегацию препарата, подбирать наиболее комфортные условия хранения, оценивать степень чистоты препаратов при различных выделениях.
Термодинамическая стабильность является фундаментальной для биологической функции белков. Поэтому информация о стабильности белка имеет важное значение для изучения структуры белка и конформационного состояния и может также использоваться для косвенного мониторинга белок-лигандных взаимодействий.
